强直性脊柱炎髋关节韧带组织培养模型的建立及腺病毒转染的实验研究

摘要：背景:强直性脊柱炎(AS)是一种与炎症紧密相关但病因尚未完全阐明的慢性进行性结缔组织疾病.目的:本研究拟通过构建和比较AS韧带组织体外原位(in situ)、2D细胞贴壁体外(in vitro)及3D水凝胶体外培养模型,旨在探索更适合模拟AS韧带体外的培养模型.方法:AS髋关节韧带组织取自我科4例重度AS拟行髋关节置换的患者,平均年龄(44.0-4.1)岁.髋关节组织块常规消化获得单细胞,并行倒置相差显微镜观察和抗vimentin免疫荧光染色(IFC)鉴定检查.对上述髋关节韧带组织与成纤维细胞分别行组织块原位、体外2D贴壁和3D海藻酸盐水凝胶法培养,重组腺病毒(rAd)5-1acZ转染上述标本14d后,分别采用大体观察、HE染色、Hoechst 33258实验、X-ga1染色、抗β-ga1免疫组织化学染色和酶联免疫吸附实验(ELISA)等对细胞形态与增殖能力、病毒转染效率和致炎性细胞因子表达等进行检测.结果:第2代AS髋关节韧带细胞抗vimentin IFC检测均出现明显的红色荧光,结果阳性,表明分离培养的细胞为成纤维细胞.rAd5-1acZ转染上述3种模型14d后,倒置相差显微镜下观察HE染色后的细胞形态并计数单位面积下的细胞数、Hoechst 33258检测细胞DNA含量和ELISA法检测细胞分泌功能提示,3种模型中以2D平面的细胞增殖效率和致炎性细胞因子分泌能力强(F=12.21、14.91、282.67、350.18,P＜0.05或0.01)、但细胞“去分化”现象亦明显,而AS韧带组织原位培养和成纤维细胞3D海藻酸盐水凝胶培养条件下的细胞增殖效率和致炎性细胞因子表达能力相似(t=1.37、0.71、1.44、1.83,P＞0.05),细胞形态前后无明显变化.抗β-ga1免疫组织化学染色并计数阳性细胞数/光镜下的总细胞数得出rAd-1acZ转染3种模型效率相似,分别为65.84％、72.26％和75.39％(F=0.873,P＞0.05).结论:韧带组织原位培养和成纤维细胞3D水凝胶培养能更好地模拟AS韧带成纤维细胞体内生存环境,且rAd5-1acZ能在一定时间内有效转染以上模型.本实验结果为建立有效的AS韧带体外培养及基因修饰模型提供实验基础.